TRIzol RNA提取方法

2016-08-09 15:46:00
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摘要:TRIzol RNA提取方法

(一)试剂准备

1.TRIzol试剂。
2.氯仿
3.异丙醇
4.75%乙醇(DEPC H2O配制)
5.DEPC H2O

(二)操作步骤

1. 样品处理:
(1)培养细胞:收获细胞1-5×107,移入1.5ml离心管中,加入1ml Trizol,混匀,室温静置5min。
(2)组织:取50-100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml离心管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。
2.加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。
3.4℃离心,12000g×15min,取上清。
4.加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。
5.4℃离心,12000g×10min,弃上清。
6.加入1ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃,7500g×5min,弃上清。
7. 晾干,加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)。

(三)注意事项
1.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤(1)的比例,不能随意增加样品量或减少Trizol量,否则会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA降解。
2.实验过程必须严格防止RNsae的污染。

二、总RNA定量

RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径,用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:
RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000

RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0,故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低,说明有残余蛋白质存在;比值太高,则提示RNA有降解。

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