PCR与克隆

2016-08-09 15:46:00
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摘要:PCR与克隆

   PCR和克隆是我们十分熟悉的技术,熟悉到我们都有些陌生了,不清楚最新的进展。其实,方法开发者一直在努力扩大其用途,近年来也有一些让人吃惊的结果。那么,这些经过时间考验的技术又将会带来一个怎样的未来?也许会是更大、更快、更小。

        1. 更大。你想要将一个DNA片段插入载体中?没问题。那么两个片段呢?好吧,难一点,但是也能做到。那五个怎么样?如今我们正走入一个灰色地带;这可能需要一些时间。随着研究人员在合成生物学等领域的研究愈加深入,他们需要一些克隆方法,以一种简单的方式插入多个DNA片段,比如不依赖于连接的克隆(LIC)或Gibson拼接。

Gibson拼接是JCVI的Daniel Gibson在2009年发明的新方法。它利用核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶进行拼接,需要相邻的具有重叠序列的DNA片段。核酸外切酶从5’ 端降解核苷酸,且不与DNA 聚合酶竞争。双链DNA 被消化产生突出的单链DNA,重叠序列特异性退火,此时,外切酶逐渐热失活。DNA聚合酶和DNA连接酶修复连接成完整的双链 DNA分子,从而实现无痕拼接。这种技术非常高效,而我们有理由相信,2014年在大规模基因拼接上有更多改进。

        2. 更快。PCR需要时间。我们需要反复的变性、退火和延伸,才能产生足够量的产物用于分析。但如果这一过程能够加快而不影响质量呢?在过去几年,随着DNA聚合酶和PCR仪器的改造,PCR技术已经变得越来越快。然而,随着人们对个性化医疗和基因检测的兴趣日益增加,也希望看到新的快速且高质量的PCR方法。目前,许多新的测序策略都依赖重新改造的聚合酶,这也预示着迷你PCR的革命。2014年,我们有望看到这些重新改造的聚合酶的更多应用,包括更快的PCR循环条件,更小、可移动的仪器,将PCR从传统实验室的局限中解放出来。

        3. 更小。近两年,单细胞成为大家关注的焦点。尽管我们有大量关于细胞群体的数据,但我们对单个细胞的行为还是知之甚少,比如它如何应对特定的刺激。在2013年,许多研究都关注单细胞水平的生物学,而研究人员也热衷于每次对一个细胞进行研究。

        尽管单细胞分析存在不少挑战;起始材料的量太少,很难确保只有单个细胞。但随着新技术的出现,如数字PCR和微滴式数字PCR,以及微流体技术的改进,研究人员也开始实现单细胞生物学的探索。到2014年,我们预计单细胞应用的数量会激增,而适用于单细胞的PCR方法也会如雨后春笋般冒出来,带来新的生物学发现。

        今年是PCR技术的“三十岁生日”。这些年来,从PCR到定量PCR再到数字PCR,技术在不断发展,也带来更广泛的应用。下一个三十年,也许PCR会给我们带来更多惊喜。


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